การผลิตปริมาณสูงและการตรึงเอนไซม์อะลิฟาติกอะมิเดสสำหรับประยุกต์ใช้ในกระบวนการสลายอะคริลาไมด์และอุตสาหกรรมการผลิตกรดอะคริลิก

Abstract

การใช้สารพิษอะคริลาไมด์ที่มีแนวโน้มเป็นสารก่อมะเร็งในคนอย่างกว้างขวางส่งผลให้พบการปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อม ในความเป็นพิษของอะคริลาไมด์ยังมีจุลินทรีย์บางชนิดสามารถใช้พลังงานจากอะคริลาไมด์ในการเจริญได้ โดยเกิดการสลายอะคริลาไมด์เป็นแอมโมเนียและกรดอะคริลิก จากการทำงานของเอนไซม์อะมิเดสหรืออะมิโดไฮโดรเลส (CE 3.5.1.4) ด้วยปฏิกิริยาดีอะมิเนชั่น ในรายงานการวิจัยนี้ได้มุ่งเป้าไปที่การใช้เทคนิคพีซีอาร์หาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนอะลิฟาติกอะมิดิสใน Enterobacter aerogenes ซึ่งเป็นแบคทีเรียสลายอะคริลาไมด์ชนิดใหม่ที่คัดแยกได้จากน้ำทิ้งชุมชนใกล้บริเวฯนิคมอุตสาหกรรมในจังหวัดชลบุรีและมีศักยภาพในการสลายอะคริลาไมด์สูงที่สุดในจำนวนแบคทีเรียสลายอะคริลาไมด์ที่มีในห้องปฏิบัติการชีวเคมีสิ่งแวดล้อมและจุลินทรีย์บำบัด ภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา การทดลองเริ่มต้นจากการใช้ตีเจนเนเรซีไพรเมอร์ที่ออกแบบมาจากลำดับกรดอะมิโนบริเวณอนุรักษ์ของยีนอะมิโดไฮโดรเลสในแบคทีเรียสกุล Enterobacter spp. เพิ่มปริมาณและโคลนยีนอะมิเดสช่วงปลายอะมิโนและปลายคาร์บอกซี ที่ประกอบด้วยนิวคลีโอไทดืจำนวน 297 และ 354 คู่เบสตามลำดับ เข้าสู่พลาสมิด pUC118 และทรานส์ฟอร์มเข้า Escherichia coli DH5a นำลำดับนิวคลีโอไทด์ที่หาได้มาออกแบบไพรเมอร์ชุดใหม่เพิ่มเพิ่มปริมาณชิ้นยีนอะลิฟาติกอะมิเดสในช่วงกลางและช่วงปลาย 3' ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ย้อนกลับแบบจำเพาะ โคลนผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ที่ได้เข้าสู่พลาสมิด pTG19-T และหาลำดับนิวคลีโอไทด์ทั้งหมด ผลการทดลองที่ได้พบลำดับนิวคลีโอไทด์ของยียนอะลิฟาติกอะมิเดสของ E. aerogenes ขนาด 726 คู่เบส ที่สามารถคาดเดาเป็นกรดอะมิโนจำนวน 242 ตัว และมีความคล้ายคลึงมากกว่าร้อยละ 80 กับยีนของเอนไซม์ในกลุ่มไนไตร์เลส/ไซยาไนด์ ไฮโดรเลสและอะมิเดสของ enterobacteriaceae ที่มีในฐานข้อมูลโลก และลำดับกรดอะมิโนที่คาดเดาจากลำดับนิวคลีโอไทด์ที่หาได้พบความเหมือนมากว่าร้อยละ 88 กับเอนไซม์อะมิเดส จาก E. aerogenes พบว่าเอนไซม์มีโครงสร้างเป็นโปรตีนก้อนกลมแบบ a/b ที่ประกอบด้วย แอลฟา-ฮีลิกซ์ จำนวน 6 เกลียวและบีตา-ชีท 6 สายที่จับกันเป็นแผ่นเรียบ 2แผ่น ที่มีความคล้ายคลึงร้อยละ 45 กับโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ไนตราเลสจาก Xanthomonas camprestis ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ตัดพันธะระหว่างอะตอมคาร์บอนและไนโตรเจนที่ไม่ใช่พันธะเพปไทด์ ผลการทดลองที่ได้แสดงถึงความสำเร็จในการใช้เทคนิคพีซีอาร์เพิ่มปริมาณชิ้นยีนอะเมิเดสของ E. aerogenes ซึ่งจะเป็นข้อมูลพื้นฐานในการโคลนและแสดงออกยีนดังกล่าวในระบบโปรคาริโอตต่อไป